گارکاه آموزش روشهای استخراج مولکولی (DNA/RNA/Protein Extraction)
صفحه اصلی »
گارکاه آموزش روشهای استخراج مولکولی (DNA/RNA/Protein Extraction)
مبانی استخراج مولکولی
- مفهوم استخراج DNA/RNA/Protein
- نقش لیز سلولی، جداسازی و خالصسازی
- تفاوت استخراج دستی و کیتبیس
- اصول شیمیایی استخراج (Lyse–Bind–Wash–Elute)
آشنایی با انواع نمونهها و آمادهسازی اولیه
- نمونههای رایج: خون، سرم، بافت، سلول، سواب، پاتوژنها
- روشهای نگهداری نمونه قبل از استخراج
- جلوگیری از تخریب DNA/RNA
- همگنسازی (Homogenization)
- نکات مربوط به RNase و DNase
استخراج DNA
- روشهای کلاسیک: فنل/کلروفرم، CTAB
- روشهای کیتبیس: ستونی (Silica column) و مغناطیسی
- مراحل: لیز → اتصال → شستوشو → الوشن
- استخراج DNA ژنومی vs پلاسمیدی
- افزایش کیفیت محصول استخراج
- جلوگیری از اسمیر و برش DNA
- تمرین عملی استخراج DNA از نمونه سلولی
استخراج RNA
- حساسیت RNA و نقش RNaseها
- روشهای TRIzol، Phenol–Chloroform
- روشهای کیتبیس (Silica column)
- حذف DNA ژنومی (DNase Treatment)
- اصول جداسازی فازها در TRIzol
- جلوگیری از تخریب RNA
- ارزیابی کیفیت RNA (۲۸S/۱۸S rRNA)
استخراج پروتئین
- اصول لیز سلولی برای پروتئین
- انواع بافرهای لیز (RIPA، NP-40، Urea)
- استفاده از مهارکنندههای پروتئاز
- سانتریفیوژ، جمعآوری سوپرناتانت
- تعیین غلظت با روشهای BCA/Bradford
خالصسازی و سنجش کمّی اسیدهای نوکلئیک
- سنجش غلظت با NanoDrop
- نسبتهای خلوص (۲۶۰/۲۸۰ و ۲۶۰/۲۳۰)
- محاسبه غلظت و حجم مناسب
- مشکلات رایج در خلوص پایین
الکتروفورز و ارزیابی کیفیت محصول
- اصول ژل آگارز برای DNA/RNA
- لود کردن نمونه و Ladder
- تشخیص کیفیت DNA (Sharp bands)
- تشخیص کیفیت RNA (باندهای 28S/18S)
- بررسی آلودگیها یا تخریب نمونه
عیبیابی (Troubleshooting)
- محصول کم یا بیکیفیت
- آلودگی پروتئینی یا فنلی
- تخریب RNA
- وجود DNase/RNase
- مشکلات مربوط به بافرها و کیتها
نکات ایمنی و بخش عملی
- کار با مواد خطرناک (فنل، کلروفرم، TRIzol)
- استفاده از PPE و هود شیمیایی
- اجرای یک استخراج کامل (DNA یا RNA)
- رفع اشکال و بررسی نتایج به صورت عملی
