سرفصل کارگاه

مبانی و اصول کلونینگ سلولی

  • تعریف کلونینگ سلولی و تفاوت آن با کلونینگ ژنی
  • ماهیت هتروژنیسیته در سلول‌های یوکاریوتی
  • اهمیت ایجاد کلون‌های پایدار (Stable clones)
  • کاربردهای اصلی کلونینگ:
    • تولید سلول‌های تراریخته
    • تعیین عملکرد ژن‌ها
    • بیان پروتئین نوترکیب
    • مطالعات دارویی و مهندسی سلولی

معرفی روش‌های کلونینگ

  • Limiting dilution cloning
  • Colony picking / Cloning rings
  • Soft agar cloning
  • Semi-solid media cloning
  • Single-cell FACS sorting
  • Microfluidics-based cloning
  • مزایا و محدودیت‌های هر روش

آماده‌سازی سلول و محیط کشت

  • انتخاب سل‌لاین مناسب (CHO، HEK293، HeLa، NIH-3T3 و…)
  • انتخاب محیط کشت و افزودنی‌ها (Serum، Antibiotics، Supplements)
  • کنترل کیفیت سلول قبل از کلونینگ
  • بررسی Confluency مناسب برای شروع فرآیند
  • استانداردسازی شرایط CO₂، دما، رطوبت و pH

کلونینگ با رقیق‌سازی محدود (Limiting Dilution)

  • صول ریاضی توزیع سلول در چاهک‌ها
  • تهیه سوسپانسیون سلولی با غلظت دقیق
  • Seed کردن ۰.۵–۱ سلول در هر چاهک ۹۶-well
  • پایش چاهک‌ها برای پیدایش کلنی تک‌سلولی
  • انتخاب کلنی مناسب و گسترش آن
  • مشکلات رایج: عدم رشد، چندسلولی شدن، آلودگی

کلونینگ با جداسازی فیزیکی

  • Colony picking و روش‌های مشاهده کلنی‌ها
  • استفاده از Cloning ring برای جداسازی کلنی چسبنده
  • برداشتن کلنی بدون آسیب
  • انتقال کلنی به پلیت یا فلاسک جدید
  • تضمین خلوص تک‌سلولی

کلونینگ با FACS (Single-Cell Sorting)

  • اصول فلوسایتومتری و پارامترهای FSC/SSC
  • انتخاب سلول‌های مثبت بر اساس مارکر فلورسنت
  • تنظیمات دستگاه برای sort کردن یک سلول در هر چاهک
  • نکات جلوگیری از آسیب سلولی در فرآیند Sorting
  • مزایا: سرعت بالا، دقت زیاد، تضمین تک‌سلولی بودن
  • معایب و چالش‌های تکنیکی

اعتبارسنجی کلون‌ها و ارزیابی پایداری

  • ارزیابی مورفولوژی سلول‌ها
  • تعیین viability و رشد کلنی‌ها
  • ارزیابی بیان ژن (qPCR، RT-PCR، Western blot)
  • تست پایداری بیان ژن در پاساژهای مختلف
  • ساخت پروفایل کاراکتریزاسیون هر کلون (Characterization file)

نگهداری، توسعه و بانک‌سازی کلون‌ها

  • گسترش کلونی به فلاسک‌های بزرگ‌تر
  • فریز کردن کلون‌ها در DMSO + FBS
  • نگهداری در نیتروژن مایع (LN₂)
  • ایجاد Master cell bank و Working cell bank
  • مستندسازی دقیق (Documentation & labeling)

خطاها و Troubleshooting

  • عدم تشکیل کلنی
  • رشد کند یا زوال کلنی‌ها
  • تک‌سلولی نبودن کلنی به دلیل تقسیم اولیه
  • آلودگی باکتریایی/قارچی
  • افت viability پس از پاساژ یا فریز/دفریز
  • مشکلات مرتبط با FACS sorting

بخش عملی و استانداردسازی

  • اجرای کامل یک Limiting dilution واقعی
  • کار عملی با Cloning ring و انتقال کلنی
  • مشاهده کلنی‌ها زیر میکروسکوپ
  • انتخاب بهترین کلون و انتقال آن
  • رفع اشکال و تحلیل کیس واقعی