پی سی آر ریل تایم چیست ؟ کاربرد Realtime PCR

پی سی آر ریل تایم یک نام آشنا برای افرادی است که شغل آن‌ها مرتبط با آزمایشگاه است. اما اگر یک دانشجو تازه کار هستید یا به تازگی وارد حیطه شغلی آزمایشگاهی شده‌اید، یکی از سؤال‌های اساسی شما ” RealTime PCR چیست” است.
پیش از توضیح در مورد realtime PCR باید بدانید که سیستم pcr ساده نیز وجود دارد؛ اما استفاده از آن به دلیل کم توانی در بررسی کمی بیان یک ژن به نسبت نوع ریل تایم محدود است. در ادامه این مطلب در مورد pcr ریل تایم و کاربرد آن توضیح خواهیم داد.

آشنایی با PCR ریل تایم

دستگاه پی سی آر ریل تایم دستگاهی برای بیان ژن‌ها موجودات زنده است. دستگاه پی سی آر ساده برای بررسی کمی میزان بیان یک ژن کافی نبود. به همین علت دستگاهی بنام realtime PCR را برای این کار توسعه داده‌اند. ژن های موجودات زنده در تلاشند تا محصولاتی از جنس RNA یا پروتئین بسازند.
زیرا RNA مشخص می‌کند که یک سلول در سطح فنوتیپی چه ویژگی‌هایی دارد یا این ویژگی‌ها را در چه سطحی بروز می‌دهد.
همچنین گاهی لازم است که دو سلول از نظر ویژگی‌های فنوتیپی بایکدیگر مقایسه شوند. این مقایسه در سطح DNA قابل انجام نیست. علت این امر نیز ثابت بودن ژن DNA است. این ویژگی باعث می‌شود، در بین موجودات زنده از یک گونه خاص، شباهت زیادی در یک ژن وجود داشته باشد. همین شباهت زیاد ژن سبب می‌شود تا اطلاعات درستی از میزان بیان آن ژن ارائه نشود. در عین حال نیز بسیاری از ژن‌ها به RNA تبدیل می‌شوند. به همین علت در بعضی موارد محصول ژنی به شکل RNA عرضه می‌شود و هرگز به پروتئین ترجمه نخواهد شد. از همین رو برای بیان این ژن فقط رونویسی انجام می‌شود به همین علت نیز تنها RNA مورد بررسی قرار می‌گیرد. RNA در کربن شماره ۲ داراری اکسیژن است؛ به‌علاوه‌ تک رشته و کوتاه است.
این عوامل سبب می‌شوند تا مولکول RNA نسبت به DNA واکنش پذیرتر باشد و سریع‌تر تخریب شود. باتوجه به این توضیحات برای بیان یک ژن از PCR ریل تایم استفاده می‌شود.

روش بیان ژن توسط PCR ریل تایم

برای بررسی بیان یک ژن توسط پس سی آر ریل تایم از آنزیم رونوشت بردار معکوس Reverse Transcriptase استفاده می‌شود.
به این‌صورت که مولکول‌های RNA به cDNA یا مکمل های DNA تبدیل می‌شوند. پس از پایدار شدن مولکول‌هایی که مورد سنجش قرار گرفته‌اند، برای بررسی بیان ژن وارد سیکل های پی سی آر ریل تایم (Realtime PCR) می‌شوند. دستگاه PCR ریل تایم از یک سیستم اپتیکی که میزان دی ان ای هر نمونه را محاسبه می‌کند استفاده قرار می‌کند.
پس از تبدیل RNA به cDNA یا همان مکمل‌های DNA نمونه باید برای ورود به سیکل‌های پلیمریزاسیون آماده شود. پس از آماده سازی هر نمونه DNA ، رنگی به‌عنوان سایبرگرین به آن اضافه می‌شود. این رنگ DNA را رنگی می‌کند و علاوه‌بر آن دارای خاصیت فلورسنتی نیز هست.
دستگاه ریل تایم پی سی آر باید توسط یک سیستم اپتیکی خوانش فلورسنتی را شروع کند. این خوانش فلورسنتی به ازای ساخته شدن رشته‌های DNA جدید انجام می‌شود. به این صورت که با شروع فرآیند پلیمریزاسیون Real Time PCR با ساخته شدن هر رشته DNA جدید رنگ سایبر گرین به رشته متصل خواهد شد. با اتصال این رشته‌ها عمل خود خوانش فلورسنتی توسط ریل تایم آغاز می‌شود. دستگاه پی سی آر Realtime برای هر نمونه DNA یک گراف تکثیر ترسیم می‌کند.
درخروجی نهایی، گراف ترسیم شده در نمایشگری که به RealTime PCR متصل است، نمایش داده می‌شود. هر نقطه از این نمودار میزان اتصال رنگ سایبر گرین به رشته DNA را نشان می‌دهد. وقتی این گراف به آستانه خود برسد میزان DNA بیان شده در هر نمونه را نشان می‌دهد.
این گزارشات به‌صورت کمی بیان می‌شوند به همین علت روش بیان ژن توسط دستگاه ریل تایم پی سی آر نسبت به تکنیک RT-PCR از ارزش بالاتری برخودار است. (در این تکنیک RNA در سلول به‌صورت کیفی گزارش می‌شود)

انواع PCR ریل تایم

دستگاه پی سی آر ریل تایم دارای انواع مختلفی است. این دستگاه‌ها از نظر تعداد بلوک‌ها متفاوت هستند. همچنین می‌توانند برای میکروتیوب ها با اندازه ۰.۱ و ۰.۲ مناسب باشند. رنج واکنش این دستگاه‌های ریل تایم PCR نیز با یکدیگر متفاوت است. محدوده دمایی، دقت دمایی دستگاه، سرعت افزایش و کاهش دما در آن و … نیز با یکدیگر متفاوت هستند. این تفاوت ها هستند که انواع پی سی آر realtime را شکل می‌دهند. هر یک از این پی سی آر ها دارای میکروتیوب های مخصوص با اندازه های ۰.۱ و ۰.۲ هستند که میکروتیوب استریپ یا استریپ ریل تایم نامیده می‌شوند.

نتیجه گیری:

پی سی آر ریل تایم یا RealTime PCR دستگاهی است که از آن برای بیان ژن‌های موجودات استفاده می‌شود. ریل تایم پی PCR ژن‌ها را از طریق یک گراف به‌صورت کمی بیان می‌کند. به همین علت روش بیان ژن‌ها از طریق این دستگاه از دقت بالایی برخودار است. گراف ترسیمی در نمایشگر RealTime PCR میزان DNA بیان شده در هر نمونه را نشان می‌دهد.