سرفصل کارگاه

مبانی کلونینگ پروکاریوتی

  • تعریف کلونینگ باکتریایی و مقایسه با کلونینگ یوکاریوتی
  • ساختار ژنوم باکتری و ویژگی‌های پروکاریوت‌ها
  • مسیر کلی کلونینگ:
    1. وکتور →
    2. درج ژن →
    3. Transformation →
    4. Screening →
    5. Expression
  • معرفی سیستم‌های کلونینگ E. coli (DH5α، TOP10، JM109 و …)
  • آشنایی با آنزیم‌های محدودکننده (Restriction enzymes)

آشنایی با وکتورها و عناصر کلونینگ

  • اجزاء اصلی وکتور کلونینگ:
    • Ori (محل شروع همانندسازی)
    • MCS (چندمحل برش)
    • مارکرهای آنتی‌بیوتیکی
    • Promoter ها
    • Terminator ها
  • انواع وکتورها:
    • Plasmid vectors
    • Expression vectors
    • Shuttle vectors
  • انتخاب صحیح وکتور بر اساس هدف کلونینگ

آماده‌سازی سلول‌های Competent

  • آماده‌سازی سلول‌های شیمیایی Competent (CaCl₂/CaCl₂ + RbCl)
  • آماده‌سازی سلول‌های الکتروکامپتنت (Electrocompetent)
  • تفاوت Efficiency در روش‌های مختلف
  • نگهداری Competent cell ها در دمای -۸۰°C
  • نکات حساس جلوگیری از کاهش کارایی سلول‌ها

Transformation .و وارد کردن DNA

 

  • Transformation حرارتی (Heat shock)
  • Transformation الکتریکی (Electroporation)
  • نکات کلیدی: دما، زمان شُک، ریکاوری
  • SOC medium و نقش آن
  • فاکتورهای مؤثر بر efficiency ترانسفورماسیون
  • اشتباهات رایج در وارد کردن پلاسمید

انتخاب کلونی‌ها (Screening & Selection)

  • رشد باکتری روی آنتی‌بیوتیک مناسب
  • Blue-white screening (α-complementation)
  • Colony PCR برای انتخاب کلونی صحیح
  • بررسی سایز درج (Insert size)
  • انتخاب بهترین کلون برای بیان ژن

تأیید کلون‌ها با روش‌های مولکولی

  • هضم آنزیمی (Restriction digestion)
  • استخراج پلاسمید (Miniprep)
  • الکتروفورز محصول‌ها روی ژل
  • تعیین توالی (Sanger sequencing)
  • بررسی صحت Insert و جهت قرارگیری آن

بیان ژن و ارزیابی عملکرد کلون

  • انتخاب Promoter مناسب (T7، lac، tac…)
  • IPTG induction و القای بیان ژن
  • بررسی پروتئین حاصل با SDS-PAGE
  • ارزیابی میزان بیان (Yield)
  • مشکلات مربوط به misfolding و مقادیر کم بیان

نگهداری، فریز و بازیابی کلون‌ها

  • تهیه glycerol stock (15–۲۰% glycerol)
  • فریز کردن باکتری‌ها در -۸۰°C
  • بازیابی کلون‌ها پس از thawing
  • مدیریت بانک پلاسمید و کلون‌ها (Documentation)

خطاهای رایج و Troubleshooting

  • عدم رشد کلونی‌ها
  • کلون‌های اشتباه (False positive)
  • پلاسمید بدون Insert
  • efficiency پایین در Transformation
  • مشکلات استخراج پلاسمید
  • آلودگی باکتریایی/قارچی

بخش عملی و استانداردسازی

  • اجرای کامل یک Transformation
  • انتخاب و تشخیص کلنی‌های سفید/آبی
  • انجام Colony PCR
  • استخراج پلاسمید از کلون انتخاب‌شده
  • رفع اشکال عملی و تحلیل نتایج واقعی