گارکاه آموزش وسترن بلاتینگ
مبانی و اصول وسترن بلات
- تعریف Western Blot و کاربردهای آن
- اصول آنتیژن–آنتیبادی
- مزایا نسبت به روشهای ایمونولوژیک دیگر
- مراحل کلی: SDS-PAGE → Transfer → Detection
استخراج و آمادهسازی پروتئین
- تهیه لایزات سلولی یا بافتی
- انواع بافرهای لیزکننده (RIPA، NP-40 …)
- مهارکنندههای پروتئاز و فسفاتاز
- سانتریفیوژ، جمعآوری سوپرناتانت
- تعیین شرایط نگهداری پروتئین
تعیین غلظت پروتئین
- روشهای Bradford ،BCA
- تهیه استانداردها
- خوانش با اسپکتروفتومتر
- محاسبه مقدار پروتئین لازم برای بارگذاری
الکتروفورز SDS-PAGE
- اصول جداسازی پروتئین بر اساس وزن مولکولی
- آمادهسازی ژلهای جداکننده و متمرکزکننده
- آمادهسازی نمونهها با بافر لودینگ
- بارگذاری نمونه و مارکر پروتئینی
- تنظیم ولتاژ و زمان مناسب برای جداسازی
انتقال پروتئین به غشاء (Transfer)
- معرفی غشاءهای PVDF و Nitrocellulose
- انتقال (Wet) و نیمهخشک (Semi-dry)
- آمادهسازی ساندویچ انتقال
- تنظیم جریان و زمان مناسب
- بررسی موفقیت انتقال با Ponceau S
بلوک کردن و انکوباسیون با آنتیبادی
- انواع بلاککنندهها (BSA، شیر خشک)
- کاهش پسزمینه و نویز
- آنتیبادی اولیه (Primary Ab)
- آنتیبادی ثانویه کونژوگه (HRP / AP)
- رقیقسازی، دما و زمان انکوباسیون
- شستوشو با بافر TBS-T یا PBS-T
شناسایی پروتئین (Detection)
- روش ECL (پرتابعترین روش پایه)
- روشهای رنگزا و فلورسنت
- تهیه محلولهای Substrate
- زمانبندی برای افزایش نسبت سیگنال به نویز
تصویربرداری و آنالیز دادهها
- کار با دستگاه Imaging (ChemiDoc و مشابه)
- تنظیم Exposure مناسب
- تشخیص باند صحیح
- تحلیل داده با نرمافزار ImageJ یا Image Lab
- محاسبه شدت باندها
- Normalization نسبت به Housekeeping proteins (β-actin, GAPDH, Tubulin)
عیبیابی (Troubleshooting)
- عدم مشاهده باند
- پسزمینه بالا
- باندهای غیر اختصاصی
- انتقال ناقص یا بیشازحد
- خطوط عمودی/افقی در ژل
نکات ایمنی و بخش عملی
- نکات ایمنی کار با مواد شیمیایی (SDS، متانول، ECL)
- کنترل آلودگی و رعایت PPE
- اجرای عملی یک Western Blot کامل
- رفع اشکال پایانی
