الکتروفورز (Electrophoresis) چیست؟ انواع روش ها و اجزای آن

مقدمه

الکتروفورز یکی از مهم‌ترین روش‌های آزمایشگاهی در علوم زیستی و علوم آزمایشگاهی الکتروفورز است که برای جداسازی مولکول‌هایی مانند DNA، RNA و پروتئین‌ها بر اساس بار الکتریکی و اندازه مولکولی به کار می‌رود. در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی، تست پروتئین الکتروفورز به‌طور گسترده برای بررسی اختلالات پروتئینی خون انجام می‌شود. این فرآیند با استفاده از دستگاه الکتروفورز عمودی و افقی و در محیط‌های ژلی مختلف انجام می‌گیرد. یکی از رایج‌ترین تکنیک‌های این روش، الکتروفورز ژل آگروز است روشی که عمدتاً برای جداسازی قطعات DNA کاربرد دارد و پایه بسیاری از آزمایش‌های مولکولی به شمار می‌رود. الکتروفورز electrophoresis بر پایه حرکت ذرات باردار در یک میدان الکتریکی عمل می‌کند. زمانی که میدان الکتریکی برقرار می‌شود، مولکول‌های دارای بار منفی به سمت قطب مثبت (آند) و مولکول‌های دارای بار مثبت به سمت قطب منفی (کاتد) حرکت می‌کنند. سرعت حرکت آن‌ها تابعی از اندازه، شکل و بار الکتریکی مولکول است.

اجزای الکتروفورز چیست؟

۱. منبع تغذیه (Power Supply)

• ولتاژ الکتریکی تولید می‌کند.
• باعث حرکت مولکول‌های باردار در میدان الکتریکی می‌شود.

۲. تانک یا محفظه الکتروفورز (Electrophoresis Tank / Chamber)

• ظرفی که ژل و بافر داخل آن قرار می‌گیرد.
• الکترودهای مثبت و منفی در دو طرف آن هستند.

۳. ژل (Gel Matrix)

• محیطی که مولکول‌ها در آن حرکت می‌کنند.
• معمولاً از آگارز (Agarose) برای DNA/RNA یا پلی‌آکریل‌آمید (Polyacrylamide) برای پروتئین‌ها ساخته می‌شود.
• مانند یک صافی مولکولی عمل می‌کند.

۴. شانه ژل (Comb)

• هنگام آماده‌سازی ژل در آن قرار می‌گیرد.
• چاهک‌ها (Well) را برای ریختن نمونه‌ها ایجاد می‌کند.

۵. بافر الکتروفورز (Buffer Solution)

• محلولی رسانا که ژل را می‌پوشاند.
• pH و هدایت الکتریکی مناسب را حفظ می‌کند.
• مثال: TAE یا TBE

۶. الکترودها (Electrodes)

• قطب مثبت (آند) و منفی (کاتد).
• میدان الکتریکی را در ژل ایجاد می‌کنند.

۷. رنگ یا نشانگر DNA (Stain / Dye)

• برای مشاهده باندها بعد از الکتروفورز استفاده می‌شود.
• مثل Ethidium Bromide یا SYBR Green.

۸. دستگاه مشاهده (UV Transilluminator یا Gel Documentation System)

• برای دیدن و ثبت باندهای DNA یا پروتئین روی ژل استفاده می‌شود.

انواع روش‌های آن

الکتروفورز بسته به نوع مولکول و هدف آزمایش به روش‌های مختلفی تقسیم می‌شود.

• الکتروفورز ژل آگارز (Agarose Gel Electrophoresis)

  • بیشتر برای جداسازی DNA و RNA استفاده می‌شود.
  • ژل از آگارز ساخته می‌شود و برای قطعات نسبتاً بزرگ مناسب است.

• الکتروفورز ژل پلی‌آکریل‌آمید (PAGE)

  • برای جداسازی پروتئین‌ها یا قطعات کوچک DNA استفاده می‌شود.
  • قدرت تفکیک بالاتری نسبت به آگارز دارد.

• الکتروفورز SDS-PAGE

  • نوعی PAGE است که با سدیم دودسیل سولفات (SDS) انجام می‌شود.
  • پروتئین‌ها را بر اساس اندازه مولکولی جدا می‌کند.

• الکتروفورز ایزوالکتریک (Isoelectric Focusing)

  • پروتئین‌ها را بر اساس نقطه ایزوالکتریک (pI) یعنی جایی که بار خالص آن‌ها صفر می‌شود جدا می‌کند.

• الکتروفورز دوبعدی (Two‑Dimensional Electrophoresis)

  • ترکیبی از ایزوالکتریک فوکوسینگ و SDS‑PAGE است.
  • برای جداسازی دقیق تعداد زیادی پروتئین استفاده می‌شود.

• الکتروفورز موئینه‌ای (Capillary Electrophoresis)

  • در یک لوله بسیار باریک انجام می‌شود.
  • سرعت و دقت بالایی دارد و در آنالیزهای پیشرفته کاربرد دارد.

آزمایش پروتئین الکتروفورز برای چه استفاده می‌شود؟

آزمایش الکتروفورز پروتئین (Protein Electrophoresis) برای جدا کردن و بررسی انواع پروتئین‌های موجود در خون یا سایر مایعات بدن استفاده می‌شود. در این آزمایش پروتئین‌ها بر اساس بار الکتریکی و اندازه از هم جدا شده و به چند باند تقسیم می‌شوند.

کاربردهای اصلی این آزمایش:

• تشخیص بیماری‌های کبدی

  چون بسیاری از پروتئین‌های خون در کبد ساخته می‌شوند.

• بررسی بیماری‌های کلیوی

  در بعضی بیماری‌ها پروتئین‌ها از طریق ادرار دفع می‌شوند.

• تشخیص اختلالات سیستم ایمنی

  مانند افزایش یا کاهش غیرطبیعی آنتی‌بادی‌ها.

• تشخیص برخی سرطان‌ها

  به‌ویژه مولتیپل میلوما (Multiple Myeloma) که باعث افزایش غیرطبیعی یک نوع پروتئین می‌شود.

• بررسی التهاب‌ها و عفونت‌های مزمن

در الکتروفورز پروتئین خون معمولاً این پنج گروه پروتئینی بررسی می‌شوند:

• آلبومین (Albumin)
• آلفا ۱ گلوبولین
• آلفا ۲ گلوبولین
• بتا گلوبولین
• گاما گلوبولین

چه زمانی انجام تست پروتئین نیاز است؟

پزشک در شرایط خاصی انجام این تست را درخواست می‌کند.

وجود علائم غیرطبیعی در آزمایش خون

مانند افزایش یا کاهش غیرعادی پروتئین کل.

بررسی بیماری‌های خونی

در موارد کم‌خونی‌های غیرقابل توضیح.

تشخیص بیماری‌های خودایمنی

برای بررسی اختلالات سیستم ایمنی.

پایش روند درمان

در بیماران مبتلا به مولتیپل میلوما.

محلول‌ها، مواد و وسایل مورد نیاز در الکتروفورز هموگلوبین

برای الکتروفورز هموگلوبین (Hemoglobin Electrophoresis) که برای تشخیص انواع هموگلوبین‌ مثل HbA، HbS، HbC و HbF استفاده می‌شود، به چند دسته محلول‌ها، مواد و وسایل نیاز است:

۱. محلول‌ها

• بافر (معمولاً بافر قلیایی مثل Tris–EDTA–Borate با pH حدود ۸.۴–۸.۶)
• محلول همولیزکننده (Hemolysing solution) برای آزاد کردن هموگلوبین از گلبول‌های قرمز
• محلول رنگ‌آمیزی (Staining solution) مثل Ponceau S یا Amido Black
• محلول رنگ‌بری یا شستشو (Destaining solution) برای واضح شدن باندها
• محلول شستشو یا آب مقطر

۲. مواد

• نمونه خون (معمولاً خون کامل با ضدانعقاد مثل EDTA)
• کاغذ یا ژل (مثل سلولز استات یا ژل آگار)
• نشانگر یا کنترل هموگلوبین استاندارد برای مقایسه باندها

۳. وسایل و تجهیزات

• دستگاه الکتروفورز
• منبع تغذیه (Power Supply)
• تانک یا محفظه
• میکروپیپت یا اپلیکاتور نمونه
• کاغذ صافی یا نوار سلولز استات
• لوله‌های آزمایش و رک لوله‌ها
• سانتریفیوژ برای آماده‌سازی نمونه
• انکوباتور یا خشک‌کن (در صورت نیاز)
• دستکش، پنس و وسایل آزمایشگاهی عمومی

آماده‌سازی محلول‌ها

تهیه بافر

در الکتروفورز هموگلوبین چند محلول اصلی باید آماده شود. روش کلی آماده‌سازی آن‌ها به صورت زیر است:

۱. بافر الکتروفورز

• مقدار مشخصی از تریس (Tris)، اسید بوریک یا استات و EDTA را در آب مقطر حل می‌کنند.
• pH محلول معمولاً حدود ۸.۴ تا ۸.۶ تنظیم می‌شود.
• حجم محلول را با آب مقطر به مقدار مورد نظر (مثلاً ۱ لیتر) می‌رسانند.

۲. محلول همولیزکننده (Hemolysing Solution)

• مقدار کمی ماده همولیزکننده (مثل ساپونین یا آب مقطر در برخی روش‌ها) به گلبول‌های قرمز اضافه می‌شود.
• این محلول باعث شکستن گلبول‌های قرمز و آزاد شدن هموگلوبین می‌شود.

۳. محلول رنگ‌آمیزی

• رنگی مانند Ponceau S یا Amido Black در آب مقطر یا محلول اسیدی ضعیف حل می‌شود.
• این محلول برای نمایان کردن باندهای هموگلوبین بعد از الکتروفورز استفاده می‌شود.

۴. محلول رنگ‌بری (Destaining Solution)

• معمولاً از محلول اسید استیک رقیق یا مخلوط متانول و اسید استیک استفاده می‌شود.
• این محلول رنگ اضافی را از ژل یا نوار حذف می‌کند تا باندها واضح‌تر شوند.

۵. محلول شستشو

• آب مقطر یا بافر رقیق برای شستشوی ژل یا نوار پس از رنگ‌آمیزی استفاده می‌شود.

تفاوت‌های الکتروفورز هموگلوبین و سرم

الکتروفورز هموگلوبین و الکتروفورز پروتئین سرم از نظر نمونه، هدف و نوع مواد جداشده با هم فرق دارند.

۱. نوع نمونه

• الکتروفورز هموگلوبین: از خون کامل (گلبول‌های قرمز) استفاده می‌شود.
• الکتروفورز سرم: از سرم خون (بخش مایع خون بعد از لخته شدن) استفاده می‌شود.

۲. ماده مورد بررسی

• هموگلوبین: انواع هموگلوبین داخل گلبول قرمز مثل HbA، HbS، HbC، HbF.
• سرم: پروتئین‌های سرم خون مانند آلبومین و گلوبولین‌ها.

۳. هدف آزمایش

• هموگلوبین: تشخیص اختلالات هموگلوبین مثل تالاسمی و کم‌خونی داسی‌شکل.
• سرم: بررسی بیماری‌های کبدی، کلیوی، التهابی و برخی سرطان‌ها مثل مولتیپل میلوما.

۴. باندهای حاصل

• هموگلوبین: باندهای مربوط به انواع هموگلوبین دیده می‌شود.
• سرم: معمولاً ۵ باند اصلی پروتئینی دیده می‌شود: آلبومین، آلفا۱، آلفا۲، بتا و گاما.

۵. محل پروتئین‌ها

• هموگلوبین: داخل گلبول‌های قرمز قرار دارد.
• سرم: در پلاسما یا سرم خون محلول هستند.

ترکیب و ساختار ژل آگارز

اجزای اصلی آن عبارت‌اند از:

• آگارز (Agarose)

  یک پلی‌ساکارید طبیعی که از جلبک‌های قرمز دریایی به‌دست می‌آید و ماده اصلی تشکیل‌دهنده ژل است.

• بافر الکتروفورز

  محلولی که آگارز در آن حل می‌شود و محیط رسانای الکتریکی ایجاد می‌کند.

  رایج‌ترین بافرها:

  • TAE (Tris–Acetate–EDTA)
  • TBE (Tris–Borate–EDTA)

• رنگ‌های نشانگر DNA (در برخی موارد)

  برای مشاهده DNA در ژل اضافه می‌شوند، مانند:

  • Ethidium Bromide
  • SYBR Green
  • GelRed

ساختار ژل آگارز

• وقتی آگارز در بافر حرارت داده و سپس سرد شود، شبکه‌ای سه‌بعدی از رشته‌های پلی‌ساکاریدی تشکیل می‌دهد.
• این شبکه دارای منافذ ریز (pore) است.
• مولکول‌ها هنگام الکتروفورز از میان این منافذ عبور می‌کنند.
• مولکول‌های کوچک‌تر سریع‌تر حرکت می‌کنند و مولکول‌های بزرگ‌تر کندتر حرکت می‌کنند.

اندازه منافذ ژل به غلظت آگارز بستگی دارد:

• ژل با غلظت کم (مثلاً ۰.۷%) → منافذ بزرگ‌تر → مناسب برای DNAهای بزرگ
• ژل با غلظت زیاد (مثلاً ۲%) → منافذ کوچک‌تر → مناسب برای قطعات کوچک DNA

نحوه عملکرد الکتروفورز ژل آگارز

ایجاد میدان الکتریکی

با اعمال ولتاژ، میدان الکتریکی برقرار می‌شود.

حرکت مولکول‌ها در ژل

DNA به دلیل بار منفی به سمت آند حرکت می‌کند.

تأثیر اندازه و بار مولکول

قطعات کوچک‌تر سریع‌تر حرکت می‌کنند.

نقش بافر در الکتروفورز

بافر از تغییر pH و افزایش حرارت جلوگیری می‌کند.

مراحل اجرای الکتروفورز ژل آگارز

تهیه ژل آگارز

آگارز در بافر حل و حرارت داده می‌شود.

بارگذاری نمونه

نمونه با بافر بارگذاری مخلوط شده و در چاهک قرار می‌گیرد.

اجرای الکتروفورز

ولتاژ مناسب اعمال و حرکت نمونه‌ها مشاهده می‌شود.

رنگ‌آمیزی و مشاهده باندها

از رنگ‌هایی مانند اتیدیوم بروماید یا جایگزین‌های ایمن استفاده می‌شود.

تفسیر نتایج

مقایسه باندها با مارکر وزن مولکولی انجام می‌شود.

جمع‌بندی

الکتروفورز یکی از بنیادی‌ترین و در عین حال کاربردی‌ترین تکنیک‌های آزمایشگاهی در علوم زیستی و علوم آزمایشگاهی است. از الکتروفورز ژل آگارز در مطالعات مولکولی گرفته تا تست پروتئین الکتروفورز و الکتروفورز هموگلوبین در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی، این روش نقش مهمی در تشخیص بیماری‌ها ایفا می‌کند. آشنایی تئوری دقیق با اصول، اجزا و انواع الکتروفورز برای دانشجویان علوم آزمایشگاهی ضروری است و پایه‌ای برای درک عمیق‌تر تکنیک‌های پیشرفته‌تر محسوب می‌شود.

سوالات متداول

الکتروفورز چیست؟

روشی آزمایشگاهی برای جداسازی مولکول‌های باردار بر اساس اندازه و بار الکتریکی در یک میدان الکتریکی است.

تفاوت دستگاه الکتروفورز عمودی و افقی چیست؟

دستگاه افقی معمولاً برای ژل آگارز و DNA و دستگاه عمودی برای PAGE و پروتئین‌ها استفاده می‌شود.

تست پروتئین الکتروفورز چه کاربردی دارد؟

برای بررسی الگوی پروتئین‌های سرم و تشخیص بیماری‌هایی مانند مولتیپل میلوما کاربرد دارد.

الکتروفورز ژل آگارز چیست؟

روشی برای جداسازی قطعات DNA و RNA با استفاده از ژل آگارز به‌عنوان بستر جداسازی است.