الایزا (Enzyme – Linked Immunesorbent Assay) یک آزمون ایمونولوژیکی رایج مورد استفاده برای اندازهگیری آنتیبادیها، آنتیژنها، پروتئینها و گلیکوپروتئینها در نمونههای بیولوژیکی است. این روش آزمایشگاهی بیوشیمیایی ساده حساسیت بالایی دارد؛ زیرا بطور همزمان چندین نمونه را آنالیز میکند و روشی ساده برای پی بردن به اختلالات سیستم ایمنی است.
با استفاده از این روش ساده که در پزشکی و کنترل کیفی صنایع غذایی کاربرد فراوانی دارد، میتوان وجود یا عدم وجود آنتیژن و آنتیبادی را در یک نمونه بررسی کرد. در این تکنیک مقدار آنتیژن فیکس شده در سطح پلیت که با یک آنتیبادی خاص که روی سطح ریخته میشود به آنتیژن متصل میشود. این آنتیبادی متصل به آنزیم است و در یک مرحله ، مادهای به آن اضافه میشود که آنزیم بتواند برخی سیگنالهای قابل تشخیص مثل تغییر رنگ را با یک ماده شیمیایی ایجاد نماید.
روش انجام آزمون الایزا
آزمون الایزا بهصورت عمومی روی ۹۶ چاهک انجام میشود و هر کیت الایزا یک آنتیژن مشخص را اندازهگیری میکند که کیتهای آن برای گستره متنوع و فراوانی از آنتیژنها، موجود هستند. الایزا برای شناسایی محصول نهایی از دو مجموعه از آنتیبادی استفاده میکند. در مرحله اول، صفحه الایزا با گیرندهی آنتیبادی، کوت شده و هر آنتیبادی باند نشده از صفحه شسته خواهد شد.
در مرحله بعد، نمونه اضافه خواهد شد و هر آنتیژنی که در نمونه پیدا میشود، به آنتیبادی گیرنده (یک آنتیبادی که برای اتصال به آنتیژن موردنظر تهیه شده است) وصل میشود. تست الایزا با روش های گوناگونی انجام میشود که به صورت کلی به دو دسته الایزا مستقیم و غیرمستقیم تقسیم بندی میشود.
در این تکنیک برای تشخیص حضور آنتیژنها از آنتیبادی استفاده میشود. برای اینکه از اتصال آنتیژن به آنتیبادی کوت شده مطمئن شویم، نمونهها را معمولاً دو یا سه بار در غلظتهای متفاوت اضافه میکنیم و هر نمونه اضافه از صفحه شسته خواهد شد. در مرحله بعد آنتیبادی شناساگر اضافه میشود. این آنتیبادی معمولاً با یک آنزیم مثل horse radish peroxidase نشانه گذاری شده است. این آنتیبادی به آنتیژنهای روی صفحه باند میشود و در نهایت یک سوبسترا به صفحه اضافه میشود. تکنیک الایزا کروموژنیک است و به این ترتیب با استفاده از یک واکنش سوبسترا را به فرآورده رنگی تبدیل میکند. در نهایت با یک پلیت ریدر میتوان میزان آن فرآورده رنگی را اندازهگیری کرد.
مراحل انجام الایزا تقریبا در تمامی انواع آن مشترک است و شامل موارد زیر میباشد:
- پوششدهی که به معنی جذب یک آنتیژن یا آنتیبادی با سطوح جامد است.
- افزودن نمونه
- انکوباسیون واکنشگرها بعد از گذشت زمان
- برای جدا کردن واکنشگرهای متصل شده و واکنش داده از واکنشگرهای آزاد و متصل نشده توسط واشر الایزا آن را شستشو میدهیم.
- آنتیبادی لینک شده با آنزیم را اضافه میکنیم.
- پس از انکوباسیون واکنشگرها دوباره شستشو میدهیم.
- زیرلایه آنزیم را در جهت واکنش دهنده اضافه میکنیم.
- انکوباسیون واکنش
- واکنش آنزیمی توسط متوقف کنندهها اتمام مییابد و یک اپراتور دانسیته نوری را میخواند.
الایزا مستقیم:
در روش الایزا مستقیم آنتیژن یا آنتیبادی مورد نظر بطور مستقیم بر سطح فاز جامد پوشش داده میشود و سپس آنتیبادی یا آنتیژن مکمل نشاندار شده آن به سیستم اضافه میشود. در صورتیکه سیگنال تولیدی را آنالیز کنیم میتوان به وجود آنتیژن یا آنتیبادی موردنیاز پی برد. این روش بیشتر کاربرد تحقیقاتی دارد. روش مستقیم نسبت به غیرمستقیم خیلی سریعتر انجام میشود چون فقط یک آنتیبادی استفاده میشود و مراحل کمتر است. از معایب این روش این است که آنتیبادی اولیه باید بطور جداگانه لیبل شود بنابراین کمی زمانبر میباشد و همچنین سیگنال ضعیفی دارد.
الایزا غیرمستقیم:
در روش الایزا غیرمستقیم سرم رقیق شده به آنتیژنهای پوشش دار در فاز جامد اضافه میشود، سپس نمونه را به آن اضافه کرده و پس از گذشت زمان انکوباسیون و یک مرحله شستشو، آنتی هیومن گلبولین نشاندار شده با آنزیم به چاهک اضافه میشود. این روش جهت شناسایی آنتیبادی اختصاصی یا تیتراسیون آنتیبادی در سرم استفاده میشود. در این نوع الایزا دو مرحله اتصال درگیر است. آنتیبادی اولیه و آنتیبادی ثانویه لیبل شده به ترتیب باید انکوبه شوند. در این مدل الایزا ممکن است سیگنال های غیراختصاصی واکنشهای متقاطع ایجاد شود.
تکان دادن میکروپلیتها از مهمترین بخشهای تکنیک الایزا میباشد. چرا که تاثیر زیادی در تغییر رنگ محیط آنزیمی پس از افزودن محلول اسیدی دارد. استفاده از روتاتور معمولی با قطر چرخش زیاد و تعداد دور کم و در نتیجه تکان دادن آهسته میکروپلیتها باعث خوب مخلوط نشدن معرفها و در نتیجه ادامه و پیشرفت جزئی واکنش در طی زمان و بروز خطا میشود. همچنین تکان شدید این پلیتها نیز باعث آلوده شدن چاهکهای میکروپلیت باهم میشود. شیکر الایزا دستگاهی است که با حرکت سریع با قطر چرخش کم باعث اختلاط مناسب معرفها و در نتیجه پیشرفت واکنش در طی زمان میشود.